Sposób wizualnego wykrywania i diagnostyki mikroorganizmów

Istota wynalazku

Zgłoszona metoda zalicza się do grupy diagnostycznych metod genetycznych, umożliwiających wykrywanie nawet niewielkich ilości materiału genetycznego (DNA) pochodzącego od mikroorganizmów, w tym również tych chorobotwórczych.

W przypadku tego typu metod, wykrywanie docelowo poszukiwanego DNA odbywa się poprzez powielanie wyjściowej (znajdującej się w badanym materiale) liczby cząsteczek DNA do momentu, w którym staną się one możliwe do zobrazowania. Dzięki temu możliwe jest wykrycie nawet niewielkich ilości DNA. Powielanie DNA odbywa się w sposób specyficzny poprzez zastosowanie specjalnie zaprojektowanej pary, krótkich fragmentów DNA tzw. starterów oraz białka polimerazy DNA. Użycie odpowiednich starterów pozwala namnożyć, a następnie zobaczyć tylko interesujące nas cząsteczki DNA np. te pochodzące od chorobotwórczego mikroorganizmu. Inne, obecne w badanym materiale cząsteczki DNA pochodzące np. od dawcy materiału (badanego człowieka, zwierzęcia, czy też rośliny), nie są wówczas powielane. W przypadku, gdy poszukiwanych cząsteczek DNA nie ma w badanym materiale, do powielenia nie dochodzi i uzyskujemy wynik ujemny. W sytuacji, gdy poszukiwane DNA znajduje się w badanej próbie i zostanie namnożone, konieczne jest zastosowanie techniki, która pozwoli nam potwierdzić obecność, czy też w jakiś sposób „zobaczyć” powielone DNA. Do tej pory opracowano kilka sposobów wizualizacji namnożonego DNA. Sposoby te wymagają użycia specjalistycznych i często drogich sprzętów, których obsługa, jak i interpretacja generowanych przez nie wyników wymaga zaangażowania wykwalifikowanych pracowników.

Opracowana przez nas metoda również funkcjonuje na zasadzie powielania DNA, jednakże od analogicznych metod typu PCR (Polymerase Chain Reaction), czy też qPCR (PCR w czasie rzeczywistym), odróżnią ją nowatorski, przy czym bardzo prosty sposób wizualizacji namnożonego DNA. W zaproponowanej przez nas metodzie o obecności docelowo poszukiwanego DNA, świadczy pojawienie się zielono-żółtego zabarwienia roztworu w probówce, w której prowadzona jest reakcja. W sytuacji, gdy w badanym materiale nie ma poszukiwanego DNA, zawartość probówki pozostaje bezbarwna i w konsekwencji w bardzo prosty sposób możemy odróżnić wynik pozytywny od negatywnego.

Jak to działa?

Uzyskanie zielono-żółtego zabarwienia jest możliwe dzięki zastosowaniu w reakcji dodatkowego, krótkiego fragmentu DNA tzw. sondy. W odróżnieniu od starterów, sonda posiada na jednym końcu znacznik fluorescencyjny, który wzbudzony światłem UV emituje światło fluorescencyjne o zielono-żółtym zabarwieniu. Na drugim końcu sondy znajduje się z kolei cząsteczka wygaszającą tę fluorescencję. W takim ułożeniu obydwie cząsteczki znajdują się blisko siebie i silniejsza w działaniu cząsteczka wygaszająca tłumi emitowane przez znacznik światło. Sytuacja taka ma miejsce, gdy w badanym materiale nie ma poszukiwanego przez nas DNA (wynik negatywny). W przypadku, gdy w badanym materiale znajduje się intersujące nas DNA, podczas jego powielania dochodzi do rozbicia sondy i znacznik fluorescencyjny uwalnia się spod działania cząsteczki wygaszającej. W konsekwencji emitowane przez znacznik zielono-żółte światło staje się dla nas widoczne (wynik pozytywny). W odróżnieniu od metody qPCR w naszym rozwiązaniu nie ma potrzeby użycia drogich detektorów by wykryć emitowane przez znacznik światło. Na skutek odpowiednio dobranych warunków reakcji namnażania DNA, świecenie to możemy zaobserwować gołym okiem bezpośrednio w probówce. Wystarczy tylko źródło światła UV by prześwietlić probówkę, w której przeprowadzono reakcję.

Korzyści z zastosowania wynalazku

Opracowana metoda stanowi alternatywę dla metod obecnie stosowanych w diagnostyce mikroorganizmów, takich jak PCR oraz qPCR. Ograniczeniem w przypadku testów opartych na technice PCR jest przede wszystkim czasochłonny etap detekcji powielonego w reakcji DNA oraz możliwość uzyskania fałszywie pozytywnych wyników na skutek zanieczyszczenia próby obcym DNA. Zdarza się tak, ponieważ etapy powielania i wizualizacji DNA są rozdzielone w czasie i przestrzeni - konieczne jest przenoszenie zawartości probówki reakcyjnej. W naszym rozwiązaniu obydwa etapy odbywają się jednocześnie w zamkniętej probówce. Ryzyko zanieczyszczenia badanej próby jest minimalne, a sama wizualizacja zajmuje tylko chwilę potrzebną na prześwietlenie probówki światłem UV. Poza tym, brak konieczności zakupu drogiego sprzętu oraz angażowania wykwalifikowanych pracowników do interpretacji wyników znacząco wpływa na obniżenie kosztów w porównaniu z testami qPCR, przy zachowaniu specyficzności reakcji na tym samym poziomie.

Potencjał komercjalizacji

Potencjał zastosowawczy i wdrożeniowy jest tak naprawdę nieograniczony. W zasadzie każdy dostępny na rynku test diagnostyczny, ukierunkowany na wykrywanie mikroorganizmów i oparty na technice PCR lub qPCR można dostosować do naszej metody. Dotychczas udało nam się wykorzystać metodę do opracowania testu umożliwiającego wykrywanie enterokrwotocznych szczepów Escherichia coli, odpowiedzialnych między innymi za wywołanie epidemii w Niemczech, w 2011 roku (odrębne zgłoszenie patentowe nr P.396283). Wówczas u ok. 4000 osób rozwinęły się objawy zatrucia pokarmowego, w wielu przypadkach doszło do groźnych powikłań, a nawet śmierci pacjenta. Nawiązując współpracę z firmą 3G Therapeutics podjęliśmy już pierwsze kroki w celu komercjalizacji tego testu. Obecnie natomiast pracujemy nad dostosowaniem metody do wykrywania patogenów przenoszonych przez kleszcze m.in. bakterii z rodzaju Borrelia wywołujących boreliozę, na którą wg danych PZH zachorowuje rocznie w Polsce średnio ok. 10 000 osób.